ANTICORPS ANTI-NUCLEAIRES : Analyse des résultats du Contrôle 2002
Docteur Bach-Nga PHAM, Service d'Hématologie et d'Immunologie, Hôpital Beaujon, Clichy 92110

L'échantillon du Contrôle National de Qualité 02G7 contenait des anticorps anti-nucléaires à titre élevé (> 1:320), donnant une fluorescence de type moucheté en immunofluorescence indirecte sur ces cellules HEp2. En terme d'identification, ces autoanticorps n'avaient pas de spécificité anti-ADN natif, mais étaient spécifiques des antigènes nucléaires solubles avec la présence d'anticorps anti-SS-A uniquement.

Les anticorps anti-SS-A sont des autoanticorps dont l'importance diagnostique est liée à leur rôle pathogène potentiel. En effet, il existe une forte association entre les anticorps anti?SS?A et le bloc auriculo-ventriculaire congénital. Le bloc auriculo-ventriculaire congénital est une atteinte cardiaque rare, mais grave, observée chez les enfants nés de mères ayant des anticorps anti-SS-A. Lorsqu'il existe, le bloc auriculo-ventriculaire, détectable dès la 18ème semaine de gestation en moyenne mais pouvant être diagnostiqué jusqu'à 27 jours après la naissance, est à l'origine d'une mortalité estimée à 20% des enfants atteints. Cette atteinte cardiaque serait liée au transfert passif trans-placentaire des anticorps anti-SS-A de la mère à l'enfant. Plusieurs hypothèses concernant le mode d'action de ces anticorps ont été avancées : induction d'une myocardite ; interférence au niveau du tissu de conduction cardiaque par interaction directe avec des protéines des canaux calciques ; enfin, interférence au niveau des phénomènes d'apoptose. Les anticorps anti-SS-A n'induisent pas obligatoirement de blocs auriculo-ventriculaires congénitaux puisque le risque a été évalué à environ 5% pour ces mères synthétisant ce type d'autoanticorps. Par contre, ce risque augmente à 15% si un premier enfant a été atteint. Il est donc essentiel que ce type particulier d'anticorps anti-nucléaires soit correctement détecté.
Les anticorps anti-SS-A sont dirigés contre des ribonucléoprotéines. Ces ribonucléoprotéines sont plus précisément des protéines de 60 kDa (forme native des protéines, aussi appelées Antigènes Ro) ou de 52 kDa, associées à des ARN synthétisés par l'ARN polymérase III. Ces ribonucléoprotéines particulières n'ont pas une localisation cellulaire univoque, puisqu'elles peuvent être nucléaires ou cytoplasmiques en fonction de différents facteurs influants sur la cellule. Ces données, ajoutées au fait que l'antigène Ro est particulièrement sensible aux conditions de culture et de fixation des cellules, expliquent que la détection des anticorps anti-SS-A soit plus difficile que la détection des autres types d'anticorps anti-nucléaires.
En terme de dépistage, l'immunofluorescence indirecte sur cellules humaines est la technique de référence pour rechercher les anticorps anti-SS-A. Les cellules HEp-2 sont les substrats classiques les plus utilisés. En présence d'anticorps anti-SS-A, on observe une fluorescence mouchetée du noyau. Un autre type de substrat, permettant d'optimiser la recherche des anticorps anti?SS-A en palliant aux variations d'expression de l'antigène Ro/SS-A, a été développé. Il s'agit des cellules appelées HEp-2000. Ces cellules sont des cellules HEp-2 transfectées avec un ADN complémentaire codant pour la protéine Ro de 60 kDa uniquement, d'où une surexpression de cette protéine. En présence d'anticorps anti-SS-A, on observe une fluorescence nucléolaire et mouchetée des cellules transfectées, soit environ 20% des cellules composant le tapis cellulaire.

Les résultats du Contrôle National de Qualité 2002 montrent que 88,8% des participants ont correctement dépisté la présence d'anticorps anti-nucléaires de spécificité anti-SS-A dans l'échantillon à analyser. Cependant, 73 laboratoires sur 616 ont rendu une réponse négative. Sur ces 73 laboratoires, 4 ont conclu à l'absence d'anticorps anti-nucléaires bien qu'ayant noté qu'il existait " un aspect de fluorescence de type SS-A " sur le substrat HEp-2000 utilisé. Ces quatre réponses ont donc été comptées comme bonnes réponses, par rapport à l'analyse globale des données concernant ce Contrôle National de Qualité. Néanmoins, cette conclusion ne saurait être acceptée pour un dossier médical, les cliniciens devant avoir une interprétation claire de l'examen demandé, à savoir " présence d'anticorps anti-nucléaires à identifier " ou " absence d'anticorps anti-nucléaires ". En dehors de ces quatre réponses, il semblerait que le manque de sensibilité d'un réactif particulier puisse expliquer un certain nombre de résultats faussement négatifs, même si d'autres facteurs sont vraisemblablement aussi en cause. Ce problème concernant la réactovigilance est en cours d'étude.
En terme d'identification, la spécificité anti-SS-A a été correctement mise en évidence par 95,7% des laboratoires.

Au total, le Contrôle National de Qualité Anticorps anti-nucléaires 2002 a mis l'accent sur la difficulté de dépister correctement les anticorps anti-SS-A puisque le nombre de résultats faussement négatifs atteint 11% en dépistage. Ce contrôle a aussi permis de réfléchir sur la notion de réactovigilance. L'importance de ces deux aspects de " contrôle " de l'AFSSAPS, Contrôle National de Qualité et Réactovigilance, concourant à une amélioration du fonctionnement des laboratoires d'analyses médicales, mérite d'être soulignée.

IMMUNOGLOBULINE MONOCLONALE : ANALYSE DES RESULTATS DU CONTROLE 2002
Bach-Nga PHAM Service d'Hématologie et Immunologie, Hôpital Beaujon , 92110 Clichy

L'échantillon du Contrôle National de Qualité 02G9 contenait une immunoglobuline monoclonale, mise en évidence par l'existence d'un pic étroit dans la zone des ß-globulines à l'électrophorèse des protéines sériques. L'immunoglobuline monoclonale était de type IgA Kappa, à une concentration d'environ 35g/l (dosage densitométrique tenant compte, en plus de l'immunoglobuline monoclonale, des protéines migrant dans cette zone des ß-globulines).

L'analyse des résultats obtenus montre un faible pourcentage de mauvaises réponses, soit 11 sur 1174. Il faut cependant souhaiter que ces mauvaises réponses soient le fait d'erreurs de recopiage et/ou de codage, plutôt que de réelles mauvaises réponses, vu la facilité de l'échantillon à analyser.

La vraie question soulevée par ce Contrôle de Qualité 2002 était l'association ou non d'une protéine de Bence Jones Kappa (chaînes légères libres monoclonales) à l'immunoglobuline monoclonale IgA Kappa sérique.
De fait, 1138 laboratoires ont conclu à la présence d'une immunoglobuline monoclonale entière uniquement, alors que 25 laboratoires ont conclu à la présence de protéine de Bence Jones, associée à l'immunoglobuline monoclonale entière. Il semblerait que cette conclusion ait été portée suite à la présence, en immunofixation, d'une bande étroite de précipitation, obtenue avec un antisérum anti-Kappa libre. Pour ces 25 laboratoires ayant conclu à la présence de protéine de Bence Jones Kappa dans l'échantillon, plusieurs réactifs différents avaient été utilisés, excluant ainsi un problème de réactovigilance sur un réactif précis.

Les analyses complémentaires, réalisées par les fabricants de réactifs eux-mêmes, sont en faveur d'un artéfact technique.
En effet, il est probable que l'immunoglobuline monoclonale, en grande quantité dans le sérum soit restée trappée dans le gel, de façon résiduelle, malgré les lavages. C'est ce qui est illustré au niveau du gel 1. Sur les pistes " A " (antisérum anti-a) et " K " (antisérum anti-Kappa), on voit une bande étroite de précipitation au même niveau de migration électrophorétique sur les deux pistes, permettant d'identifier une immunoglobuline monoclonale de type IgA Kappa. Sur la piste " K free " (antisérum anti-Kappa libre), on note une bande de précipitation migrant au même niveau électrophorétique que l'immunoglobuline monoclonale. Cette bande est également visible sur la piste " T- ", et ce malgré l'absence d'antisérum utilisé (témoin négatif). Cette même bande de précipitation est aussi présente sur la piste " L free " du gel 2 (antisérum anti-Lambda libre). L'ensemble de ces résultats prouve que la bande de précipitation " mise en évidence " avec l'antisérum anti-Kappa libre est en fait une bande de précipitation non spécifique, et qu'il n'existait pas de protéine de Bence Jones Kappa associée à l'immunoglobuline monoclonale entière.

Le principal enseignement à tirer du Contrôle de Qualité Immunoglobuline Monoclonale 2002 est de ne pas utiliser d'antisérum anti-chaînes légères libres sans les contrôles adéquats. Le premier contrôle concerne l'utilisation de l'antisérum anti-Lambda libre si on recherche la présence de protéine de Bence Jones Kappa et inversement. Le deuxième contrôle est de faire un " blanc antisérum ", c'est-à-dire dépôt de sérum, sans dépôt d'antisérum. Seule l'utilisation systématique de l'un ou l'autre contrôle permet de mettre en évidence un phénomène de précipitation non spécifique. Enfin, il faut savoir qu'il est difficile d'affirmer la présence de protéine de Bence Jones sérique, sans recherche parallèle de protéine de Bence Jones urinaire et cela, même si on utilise un antisérum anti-chaînes légères libres. En pratique courante, il est justifié de réclamer au médecin prescripteur un échantillon d'urines de 24 heures du patient, à étudier parallèlement au sérum, lorsqu'il existe une immunoglobuline monoclonale.

ANTICORPS ANTI-PHOSPHOLIPIDES : ANALYSE DES RESULTATS DU CONTROLE 2002
Dr Bach-Nga PHAM, Service d'Hématologie et Immunologie
Hôpital Beaujon, 92110 Clichy

Les anticorps anti-b2 glycoprotéine I (b2GPI) appartiennent à la famille des anticorps anti?phospholipides, marqueurs biologiques du syndrome des anti-phospholipides. Ils sont dirigés contre la b2GPI, glycoprotéine de 50 kDa, inhibiteur plasmatique de la coagulation.
Les anticorps anti-b2GPI sont classiquement détectés par technique ELISA. Actuellement, il existe deux tests pour les mettre en évidence : le test Cardiolipine-ELISA et le test b2GPI-ELISA. Le test Cardiolipine-ELISA a été le premier test ELISA mis au point pour détecter les anticorps dirigés contre les phospholipides, et plus précisément les phospholipides anioniques (cas de la cardiolipine). Les anticorps anti?phospholipides détectés par ce test ont donc été appelés anticorps anti-cardiolipine. Cependant, il est rapidement apparu que la cible des anticorps anti-phospholipides était le plus souvent des protéines associées aux phospholipides, plutôt que des phospholipides seuls. Ces protéines, appelées cofacteurs protéiques, sont multiples. La b2GPI est le principal cofacteur protéique reconnu par les anticorps anti?phospholipides détectés par le test Cardiolipine-ELISA, à savoir les anticorps anti?cardiolipine. La liaison de la b2GPI avec les phospholipides anioniques se fait au niveau du domaine V de la glycoprotéine. La b2GPI est amenée par les tampons (saturation + dilution) des tests ELISA et/ou les échantillons de sérum à tester. L'importance du rôle de cofacteur protéique joué par la b2GPI dans la détection des anticorps anti-cardiolipine a été soulignée par la " classification " de ces anticorps en anticorps anti-cardiolipine b2GPI-dépendants (anticorps reconnaissant la b2GPI associée à la cardiolipine), ou anticorps anti-cardiolipine b2GPI-indépendants (anticorps reconnaissant la cardiolipine seule). Les anticorps anti-cardiolipine b2GPI-dépendants sont associés aux maladies auto-immunes. Les anticorps anti?cardiolipine b2GPI-indépendants sont associés aux infections, bien qu'ils puissent parfois être détectés chez les patients atteints de maladies auto?immunes. L'ensemble de ces données explique qu'un autre test que le test Cardiolipine-ELISA ait été secondairement développé, à savoir le test b2GPI-ELISA.
Ce test b2GPI-ELISA permet de détecter directement les anticorps anti-b2GPI. La fixation de b2GPI purifiée sur des plaques de polystyrène irradiées (obtention de groupements carbonyle chargés négativement) mimerait la configuration des complexes b2GPI-phospholipides susceptibles d'être reconnus par les autoanticorps.

L'échantillon du Contrôle National de Qualité 02G5 contenait des anticorps anti-phospholipides de type IgG anti-cardiolipine (titre élevé), et IgG anti-b2GPI (titre faible).
L'analyse de l'ensemble des résultats a mis en exergue deux problèmes : le problème du titrage des anticorps anti-cardiolipine et celui de la sensibilité des tests de détection des anticorps anti?b2GPI.
Les anticorps anti?cardiolipine doivent être titrés, car il existe une forte corrélation entre la concentration élevée d'IgG anti-cardiolipine et le risque de survenue d'un syndrome des anti?phospholipides. En théorie, ce dosage bénéficie d'un standard international produit aux Etats?Unis, appelé " standard Harris ", dont les valeurs sont exprimées en unités GPL pour l'isotype G, et MPL pour l'isotype M. En pratique, il n'existe aucune standardisation réelle puisque plusieurs lots différents de " standards Harris " ont été produits, sans vraie concordance d'un lot à l'autre. Il est donc important de ne pas se laisser abuser par les termes " unités GPL ou MPL " et cela, même pour une même trousse commerciale. Ce problème est parfaitement illustré par les résultats du Contrôle National de Qualité, où on note une grande variabilité du titre d'IgG anti-cardiolipine rendu par les participants : moyennes des titres allant de 28,07 GPL/ml à 78,15 GPL/ml lorqu'on compare les trousses commerciales entre elles, avec des coefficients de variation allant de 17,93% à 38,66%. Les travaux tentant de proposer une véritable standardisation du dosage des anticorps anti?cardiolipine sur le plan européen sont en cours.
Le deuxième problème concerne la détection directe des anticorps anti-b2GPI. La détection de ces autoanticorps requiert des tests ayant un compromis sensibilité/spécificité acceptable, vu l'existence du test Cardiolipine-ELISA, test indirect mais ayant une bonne sensibilité pour ces autoanticorps. Les paramètres de sensibilité et spécificité d'un test dépendent en fait de la valeur seuil, valeur au?delà de laquelle un résultat est considéré comme positif. Or, la valeur seuil du test b2GPI?ELISA diffère selon le réactif utilisé, que le réactif soit un réactif " maison " ou un réactif commercialisé. Ce problème de valeur seuil explique certainement, en grande partie, les résultats discordants du Contrôle National de Qualité concernant la détection des IgG anti-b2GPI. En effet, 52 laboratoires sur 63 (82,5 %) ont rendu un résultat négatif, alors que 11 laboratoires sur 63 ont rendu un résultat positif, avec des titres proches du seuil pour certains. Ces réponses positives ont été obtenues avec des réactifs " maison " dans 6 cas, deux trousses commerciales dans 4 cas et avec un réactif non identifié dans 1 cas. Il semble donc que les réactifs " maison " aient une meilleure sensibilité que les trousses commerciales pour la détection des IgG anti-b2GPI. Le choix par les laboratoires élaborant leur propre test d'une valeur seuil plus basse que celle retenue par les fabricants est l'explication la plus plausible. Il est, en effet, pertinent pour un laboratoire hospitalier d'opter pour un test b2GPI-ELISA sensible, vu le biais de recrutement de maladies auto?immunes de certains centres. A l'inverse, il est licite que les fabricants de réactifs aient opté pour un test b2GPI-ELISA moins sensible mais plus spécifique pour répondre à une demande générale. Les deux attitudes ont leurs avantages et leurs inconvénients. Cependant, il serait peut?être souhaitable que chaque laboratoire recalcule sa valeur seuil en fonction de son recrutement propre, pour répondre au mieux à ces exigences de sensibilité/spécificité.

Au total, les résultats du Contrôle National de Qualité anticorps anti-phospholipides 2002 n'ont fait que confirmer le manque de standardisation des tests de détection concernant les anticorps anti-cardiolipine et anticorps anti-b2GPI en technique ELISA. On ne peut que souhaiter une avancée rapide sur le problème. Encore faut-il espérer l'adhésion des fabricants de réactifs aux recommandations internationales lorsqu'elles seront émises.